內(nèi)毒素的發(fā)現(xiàn)與起源（二）：生物領(lǐng)域的關(guān)注焦點(diǎn)

內(nèi)毒素的發(fā)現(xiàn)主要應(yīng)歸功于對(duì)霍亂弧菌（vibrio cholera）的研究。在19世紀(jì)后期，經(jīng)常發(fā)生霍亂流行，尤其是1892年前后，在世界一些大的海港城市發(fā)生了大規(guī)模霍亂流行，成千上萬的人因此而死亡。因此，當(dāng)時(shí)霍亂研究備受關(guān)注。1884年，Robert Koch證明霍亂弧菌為霍亂的致病菌，并在他的實(shí)驗(yàn)室里系統(tǒng)地開展了霍亂弧菌的致病性研究。當(dāng)時(shí)在該實(shí)驗(yàn)室工作的Richard Pfeiffer（1858~1945）研究發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌除釋放不耐熱的外毒素到培養(yǎng)基外，并觀察到霍亂弧菌能產(chǎn)生第2種完-全不同的毒素，這種毒素可牢固結(jié)合在細(xì)菌細(xì)胞上，具有很強(qiáng)的毒性作用，在細(xì)菌溶解時(shí)才被釋放出來。由于這種毒素與已發(fā)現(xiàn)的其他毒素明顯不同，Pfeiffer稱其為內(nèi)毒素（endotoxin）。之后“內(nèi)毒素"一詞被文獻(xiàn)廣泛引用。

幾乎同時(shí)，意大利人Eugenio Centanni（1863~1948）利用乙醇及其他分離過程，從大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌等自溶物中分離出---種無菌白色粉末的高致熱原性物質(zhì)。該物質(zhì)對(duì)熱十分穩(wěn)定，不屬于蛋白質(zhì)，且與細(xì)菌的生存和細(xì)菌感染引起的病理變化密切相關(guān)，被他稱為Pyrotoxina。應(yīng)該說，Centanni已獲得較高純度的內(nèi)毒素，是第一個(gè)認(rèn)識(shí)細(xì)菌致熱原與內(nèi)毒素間密切關(guān)系的人。

Edmundweil（1879~1922）和ArthurFelix（1887~1956）在變形桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌培養(yǎng)物呈兩種生長形式：即聚集（swarming）生長和不聚集（nonswarming）生長。他們將聚集生長的細(xì)菌稱為Hauch（德語），不聚集生長的細(xì)菌稱為Ohne hauch。并從中分離出兩種不同的物質(zhì)，被他們分別稱為H-抗原和O抗原。其中，O-杭原耐熱。實(shí)際上，O抗原就是內(nèi)毒素。此外，A Joos將從鼠傷寒菌分離得到的熱穩(wěn)定物質(zhì)稱為β-agglutinogens。

Pfeiffer的內(nèi)毒素、Centanni的pyrotoxina和其他學(xué)者分離出的細(xì)菌過濾物均為含有多種細(xì)菌產(chǎn)物的混合物。經(jīng)歷了數(shù)十年后，法國微生物學(xué)家Andre Boivin（1895~一1949）與羅馬尼亞科學(xué)家Lydia Mesrobeanu（1908~1978）一道在1932年發(fā)明了一種至今仍被廣泛采用的從革蘭陰性細(xì)菌提取內(nèi)毒素的方法：即三-氯-乙-酸（trichloroacetic acid，TCA）法。該方法分離得到的產(chǎn)物主要為多糖和脂質(zhì)，僅含少量蛋白，被他們稱為antigenes glycido-lipidiques（法語）。Pennel和Huddeleson利用TCA法從布魯桿菌中也獲得了細(xì)菌毒素，被他們稱為內(nèi)抗原（endoantigen）。Walter T.J.Morgan和Walter F.Goebel利用有機(jī)溶劑和水進(jìn)一步改進(jìn)TCA提取方法，從而使獲得的產(chǎn)物更為均一。隨后的研究中，許多學(xué)者都采用Morgan的提取物。

20世紀(jì)40年代初期，美國Bradley Coley醫(yī)師利用滅活的Bacillus prodigiousus和鏈球菌的高致熱原性混合物治療惡性腫瘤病人，取得明顯療效。Murray Shear試圖從Coley疫苗的活性成分Bacillus prodigiousus中分離出致腫瘤壞死的物質(zhì)。結(jié)果顯示，分離物主要為多糖和脂質(zhì)成分，含有少量蛋白，被Shear等命名為脂多糖（lipopolysaccharide）。

20世紀(jì)40年代后期，otto Westphal和Otto Luderitz系統(tǒng)地分析了Walter Morgan從沙門菌、大腸桿菌和其他腸道桿菌的分離物，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)分離物的致熱活性主要集中在O-抗原復(fù)合物中，且未降解多糖呈高致熱原性，結(jié)合蛋白的多糖活性較低，降解多糖和單純蛋白質(zhì)則完-全無活性。1952年，Westphal建立了一種新的更有效的分離方法，即熱-酚-水抽提法（hot-phenol-water extraction method），其分離物幾乎不含蛋白，僅含糖、磷和脂肪酸成分，具有非常強(qiáng)的生物活性，靜脈內(nèi)注射1ng/kg，就可致人發(fā)熱，被Westphal和Luderitz稱為脂多糖。該方法的建立被認(rèn)為是內(nèi)毒素研究史-上的里程碑，并成為經(jīng)典的分離方法而被廣泛應(yīng)用。

顯然，早在20世紀(jì)初期，人們已從不同的革蘭陰性細(xì)菌中分離出不同形式或不同純度的內(nèi)毒素物質(zhì)，不同的實(shí)驗(yàn)室對(duì)其有不同的命名。隨著內(nèi)毒素分離方法不斷改進(jìn)和提高，以及相關(guān)學(xué)科，如化學(xué)、生物學(xué)、血清學(xué)的發(fā)展，20世紀(jì)50年代后，人們逐步認(rèn)識(shí)到這些從革蘭陰性細(xì)菌分離得到的物質(zhì)實(shí)際上為同一種成分，并且是所有革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜上的主要結(jié)構(gòu)成分，對(duì)細(xì)菌生長和活力至關(guān)重要，是革蘭陰性細(xì)菌的主要致病因子，并將這些物質(zhì)統(tǒng)稱為內(nèi)毒素或脂多糖（LPS）。從此，內(nèi)毒素的研究日益受到微生物學(xué)家，臨床醫(yī)師、生物學(xué)家和免疫學(xué)家的普遍重視。

1952年和1958年分別在美國紐約和德國弗賴堡召開了第一、二屆內(nèi)毒素國際會(huì)議。1988年，在美國得克薩斯大學(xué)微生物學(xué)教授L.Joe Berry的倡導(dǎo)和努力下，成立了國際內(nèi)毒素學(xué)會(huì)（International Endotoxin Society，IES），第一屆學(xué)會(huì)主席為賓夕法尼亞大學(xué)免疫學(xué)教授Alois Nowotny。目前會(huì)員已遍布六大洲，39個(gè)國家，400多名會(huì)員。1994年，創(chuàng)辦了《內(nèi)毒素研究雜志》（Journal of Endotoxin Research），得克薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的David C.Morrison教授為第一任主編。