細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中凝膠法在藥品中的正確使用方法

細(xì)菌內(nèi)毒素作為外源性致熱原的內(nèi)毒素能激活中性粒細(xì)胞等，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁個層上的*結(jié)構(gòu)，會使中性粒細(xì)胞釋放一種叫內(nèi)源性熱原質(zhì)的物質(zhì)，其在體溫調(diào)節(jié)的中樞會引起發(fā)熱反應(yīng)。當(dāng)內(nèi)毒素經(jīng)消化道進(jìn)入人體不會產(chǎn)生危害，但內(nèi)毒素經(jīng)注射液等方式進(jìn)入血液時則引起癥狀不同的疾病。因此，藥品安全性檢驗一個重要項目就是藥品注射劑中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。美國科學(xué)家Levin和Bang1968年建立鱟試驗法來檢查細(xì)菌內(nèi)毒素，美國FDA于1973年制定的規(guī)則指出“鱟試劑是一種檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的靈敏指示劑。"

1.鱟試劑的特性及與內(nèi)毒素產(chǎn)生反應(yīng)的作用機理

鱟試劑是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法中最重要的試劑。它是鱟科血細(xì)胞（變形細(xì)胞）裂解液的凍干產(chǎn)物。鱟的血液中只有一種類型的血細(xì)胞參與循環(huán)就是被稱為變形細(xì)胞。目前制備細(xì)胞鱟試劑一種是東方鱟，另一種是美洲鱟。研究鱟試劑作用機理表明，細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑中鱟血細(xì)胞溶解物，產(chǎn)生一系列的凝集酶反應(yīng)，形成凝固蛋白凝膠。判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限-量能否在規(guī)定范圍，可通過用鱟試劑檢測，或者是量化革蘭陰性菌所產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素。

2.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法

2.1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品

細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)菌株由大腸桿菌提煉精制而成，是用來檢查，校準(zhǔn)，仲裁鱟試劑靈敏度、細(xì)菌內(nèi)毒素濃度測定，干擾測試和測試方案中供試品陽性對照和陽性對照溶液的制備和光度測定方法的可靠性測試、凝膠檢查鱟試劑試驗敏感性。國家標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)菌內(nèi)毒素校準(zhǔn)的參照標(biāo)準(zhǔn)，單位為內(nèi)毒素（EU），1EU等于1國際單位內(nèi)毒素（IU）。

2.2實驗準(zhǔn)備

玻璃器皿在酪酸洗液、其他熱源性滅活劑、或清洗劑將充分浸泡，控干洗液后用蒸餾水3遍以上的沖洗，放入干燥箱，在250℃干烤30min以上，用以除掉可能性存在外源性內(nèi)毒素干擾。如果用塑料的器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器具。

無熱原酶標(biāo)板

2.3鱟試劑靈敏度復(fù)核

將細(xì)菌內(nèi)毒素采樣標(biāo)準(zhǔn)品與專門的檢查水在渦流攪拌器中混合溶解15min，稀釋后測定鱟試劑的靈敏度值（λc）。每一批新批次鱟試劑全部需嚴(yán)格采用靈敏度試驗。

2.4實驗方法

將8支鱟試劑分別加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用0.1mL水溶解。按最大稀釋倍數(shù)稀釋的供試品溶液0.1mL加入2支，作為供試品溶液管，2支加入含內(nèi)毒素濃度為2λ對照溶液為供試品陽性對照管，2支加入2λ內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1mL作為陽性對照管，2支加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水0.1mL作為陰性對照管。試管混勻封口置于37C±1℃恒溫器中保溫60分鐘±2分鐘，從恒溫器中慢慢取出，極緩的倒轉(zhuǎn)180°，若未形成凝膠，或者形成凝膠不堅實、變形體從管壁下滑脫落為陰性；管內(nèi)出現(xiàn)凝膠并且凝膠不變形、如果不從管壁下滑脫落即為陽性。拿取或者保溫試管時要避免振動，以免出現(xiàn)假陰性檢測結(jié)果。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品

2.5實驗注意事項

準(zhǔn)備工作：肥皂洗手，用75%乙醇棉球消毒。應(yīng)在清潔環(huán)境中進(jìn)行操作，取樣時防止混入氣體，并防止微生物污染移液管。